Nació el 1 de marzo de 1978 en Texas, Estados Unidos. Hijo del actor Alan Roger Ackles, su contacto con el mundo del espectáculo no se hizo esperar. Fue modelo infantil y participó de varias publicidades durante su niñez. En su último año de escuela decidió estudiar medicina para convertirse en un terapeuta físico, pero pronto cambió de parecer y se mudó a Los Ángeles para iniciar su carrera como actor.

A los dieciocho años comenzó con pequeños papeles en series de televisión, como Seventh heavenMr. RhodesSweet Valley High y Cybill.

A principios del nuevo milenio, Jensen fue seleccionado para participar en le exitosa serie Dark Angel, lo que le permitió hacerse conocido en el ambiente de Hollywood.

En 2004 se presentó al casting para la cuarta temporada de Smallville, donde interpretó al misterioso Jason Teague. Y al año siguiente fue elegido para protagonizar una nueva tira llamada Supernatural, que aún continúa en pantalla. Allí, el actor encarna a Dean Winchester, quien junto a su hermano Sam (Jared Padalecki) y su padre (Jeffrey Dean Morgan) deben combatir a demonios, fantasmas, vampiros y otras criaturas similares.

En 2009, Jensen tuvo su gran salto en el cine, al protagonizar el filme My Bloody Valentine, la remake de la famosa película slasher de los ochenta.

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